Научные проекты
Биомедицинские клеточные технологии и продукты для репаративной регенерации эпителия роговицы (Блинова М.И., Александрова О.И. – равное участие; Хорольская Ю.И., Дарвиш Д.М., Нащекина Ю.А.; студенты – Журенков К.Э., Переплетчикова Д.А., Гречаная Ю.С.)
Для целого ряда офтальмологических патологий в настоящее время не существует оптимальных методов лечения, что приводит к низкой эффективности терапии и инвалидизации пациентов. Использование клеточных технологий в офтальмологии позволит осуществить прорыв в этой области.
Одним из важнейших элементов зрительного аппарата является роговица, выполняющая барьерные и оптические функции. Потеря прозрачности роговицы вследствие заболеваний и травм приводит к серьезной потере зрения или слепоте (схема). Заживление ран роговицы, являясь серьезной клинической проблемой, представляет интерес и для фундаментальной науки. Одним из основных методов хирургического лечения слепоты роговицы является кератопластика – трансплантация донорской человеческой роговицы. Основные ограничения керато- пластики связаны с рисками неоптимальных оптических результатов, проблемы с ограниченной выживаемостью аллотрансплан- тата и доступностью донорской ткани. Одним из перспективных методов репарации роговицы рассматривают трансплантацию культивируемых стволовых клеток (СК). Совместно с Кафедрой офтальмологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова мы проводим экспериментальные исследования по разработке биоинженерных конструкций (БИК) для репаративной эпителизации роговицы в случае лимбальной недостаточности (ЛН).
На рисунке: биоинженерная конструкция на основе СКСРП кролика и амниотической мембраны (слева); гистологический препарат БИК, окраска гематоксилин-эозином (справа).
В настоящее время:
Отработаны методы выделения и культивирования СК слизистой нижней губы (СКСНГ) и роговичного лимба (СКРЛ) как источников клеточного материала для будущих клеточных продуктов.
Начата работа по созданию биобанка СКСНГ и СКРЛ человека и кролика.
Отработаны методы предподготовки амниотической мембраны в качестве скаффолда для культивирования необходимых клеток.
Разработаны экспериментальные БИК на основе амниотической мембраны и коллагенового гидрогеля с использованием СКСНГ и СКРЛ человека и кролика.
В экспериментах in vitro и in vivo на лабораторных животных (кролики) были исследованы свойства трех видов синтетических полиэфирных матриц в целях определения оптимального носителя для культивирования и трансплантации СКРЛ.
В экспериментах in vivo на лабораторных животных (кролики) получены положительные результаты использования БИК на основе коллагена и амниотической мембраны с культивируемыми СКСНГ и СКРЛ для лечения тотальной ЛН.
Грант РФФИ «Сравнительное исследование возможности использования нативных стволовых клеток лимба и лимбальных стволовых клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток для восстановления роговицы», 2019–2021, № 19–34-90146. (руководитель Блинова М.И., исполнитель Хорольская Ю.И.).
Достаточно часто при различной патологии переднего отрезка глазного яблока (роговицы) развивается синдром лимбальной недостаточности, возникающий в результате дисфункции, повреждения или гибели лимбальных стволовых клеток (ЛСК), которые обеспечивают обновление эпителия роговицы. Далеко не всегда удается добиться восстановления поврежденных тканей при помощи традиционных методов, поэтому встает вопрос о разработке биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), способных компенсировать потерю функциональности ЛСК. В последние годы все большее число научных исследований сосредоточено на поиске оптимального источника клеток, необходимых для создания клеточных продуктов, направленных на восстановление роговицы глаза. Клетки лимба являются стволовыми для эпителия роговицы и необходимы для обеспечения ее целостности и прозрачности, однако, в связи с острой нехваткой донорского материала для выделения клеток рассматриваются различные варианты клеточного материала при создании БМКП.
Одним из наиболее перспективных источников клеточного материала представляются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПК), направленные в дифференцировку по типу ЛСК. ИПК человека, полученные из соматических клеток организма, открывают новые возможности в области регенеративной медицины и клеточной биологии. ЛСК из иПК могут способствовать развитию новых перспективных подходов не только в лечении различных патологий, но и при создании моделей и разработке тест-систем в офтальмологии.
В ходе проекта на базе Центра клеточных технологий Института цитологии РАН планируется получение ЛСК из иПК и сравнительное исследование эффективности применения полученных клеток с нативными ЛСК на модели лимбальной недостаточности. Эти технологии могут стать решением проблемы восстановления зрения независимо от отсутствия донорского материала.
Грант РФФИ «Применение наночастиц чувствительных к опухолевому микроокружению для тераностики первичных опухолей головного мозга и метастазов», 2019–2021, № 19–58-55001. (руководитель Н.М. Юдинцева, исполнители: Шевцов М.А., Николаев Б.П., Марченко Я.Ю., Яковлева Л.Ю., студенты – Агаджанян Н.А., Красавина Д.А.).
Разработка современных таргетных препаратов для диагностики и терапии новообразований является одним из перспективных направлений в трансляционной медицине и нейро-онкологии. Несмотря на комбинированный подход в терапии злокачественных глиальных опухолей ЦНС, общая продолжительность жизни больных не превышает 15 месяцев. Использование гибридных золотых наночастиц позволит добиться диагностики новообразований и эффективного лечения посредством радиосенсибилизации раковых клеток при лучевой терапии. Для повышения таргетных свойств гибридных наночастиц предполагается использование функционализации поверхности наночастиц моноклональными антителами, направленными к белку теплового шока Hsp70, который представлен на поверхности клеточной мембраны раковых клеток. Кроме того, планируется применение легумаин-активируемого пептида Ала-Ала-Асп-Цис-Лиз. Ранее было показано, что активация протеазы легумаина на мембране раковых клеток приводит к агрегации наночастиц, что, в свою очередь, способствует накоплению препарата в ткани опухоли. В результате проведённых исследований будет синтезирован тераностический препарат для диагностики и лечения новообразований головного мозга.
На рисунке (слева направо): ТЭМ наночастиц; наночастицы в составе эндосом в клетке (верхний ряд); окраска пурсиановым синим; конфокальная микроскопия наночастиц в клетках и тканях (нижний ряд).
Разработка биорезорбируемых тканеинженерных конструкций для регенеративной урологии (Юдинцева Н.М., Нащекина Ю.А., Хотин М.Г.)
Создание тканеинженерных конструкций (ТИК), предназначенных для замещения дефектных участков уретры, мочевого пузыря и нижних отделов мочеточников, является чрезвычайно востребованным и активно развивающимся направлением. Существующие технологии хирургической реконструкции патологически измененных структур урогенитального тракта имеют ряд существенных недостатков и осложнений. ТИК рассматриваются как временные трансплантаты, которые должны в определенные сроки замещаться собственными тканями организма при сохранении органотипического строения ткани. Настоящий проект направлен на разработку ТИК на основе гибридных биорезорбируемых матриксов из синтетических медицинских полимерных материалов, а также доступных для получения и культивирования клеток эпителия ротовой полости. В настоящий момент разрабатываются методы синтеза гибридных полимерных матриксов, а также методы культивирования клеток базального слоя буккального эпителия на созданных матриксах-носителях.
На рисунке: А – забор буккального лоскута у кролика; Б – культура клеток буккального эпителия (БЭ); В – скаффолд для культивирования клеток БЭ; СЭМ клеток на поверхности скаффолда; Д – имплантация ТИК кролику; Е – реконструированная уретра кролика; Ж – гистология биоптата; З – восстановленная ткань уретры. Конфокальная микроскопия.
Разработка методологических подходов с использованием клеточных технологий восстановления костной ткани, поврежденной туберкулезом (Александрова С.А., Блинова М.И. – равное участие; Дарвиш Д.М., Нащекина Ю.А.; студенты – Соловьева А.М., Журенков К.Э.).
Совместно с сотрудниками Отделения фтизиоостеологии и ортопедии ФГБУ «Санкт-петербургский НИИ Фтизиопульмонологии» (СПб НИИФ) проводятся исследования по выбору оптимального остеозамещающего материала для пластики операционных дефектов в радикально‑и реконструктивно-восстановительной хирургии туберкулеза костей и суставов.
Актуальность исследований обоснована необходимостью поиска и разработки новых методов пластической восстановительной хирургии костно-суставного туберкулеза. Опыт по использованию в СПб НИИФ ряда коммерческих остеозамещающих материалов для пластики дефектов кости выявил необходимость дополнительной стимуляции регенерации костной ткани при лечении туберкулезных оститов.
На рисунке: а – коллагеновые фибриллы на поверхности биоситалла; б – кость, пораженная туберкулезом (с кавернами); в – разные формы биоситалла; г – графическое изображение заполнения экспериментальной раны тканеинженерной конструкцией; д – кролик породы Шиншилла – модельный объект исследования.
На данный момент проведено сравнительное изучение токсичности и биосовместимости ряда остеозамещающих материалов разного состава в условиях in vitro на культивируемых клетках с использованием ряда методических подходов: сканирующей электронной, световой инвертированной, флуоресцентной микроскопии, а также спектрофотометрии. В настоящее время проводится доклиническое исследование созданной нами тканеинженерной конструкции эквивалента костной ткани, состоящей из мезенхимных стволовых клеток (МСК) костного мозга, коллагенового геля и стеклокристаллического материала “Биосит Ср-Элкор” (Россия) для устранения смоделированного дефекта в метаэпифизарной области бедренной кости кроликов, пораженных туберкулезом. Через 1, 2 и 4 мес кроликов выводили из эксперимента, производили забор материала формирующейся костной ткани, располагающейся на месте дефекта, и изготавливали гистологические и криостатные срезы. Материал будет проанализирован методами гистохимии и конфокальной микроскопии. Законченное исследование позволит определить наличие жизнеспособных имплантированных МСК в месте дефекта, установить происходит ли в результате формирование новой костной ткани, состояние её в течение длительного периода времени, а также механизмы участия имплантированных клеток в процессе регенерации.
Методологические подходы создания биомедицинских клеточных продуктов для устранения дефектов костной и хрящевой тканей (Александрова С.А., Блинова М.И. – равное участие, Дарвиш Д.М., Нащекина Ю.А.).
Под руководством проф. Г.П. Пинаева началась разработка методологических подходов создания биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) для устранения дефектов костной и хрящевой тканей с использованием мезенхимных стволовых клеток (МСК) костного мозга. Фундаментальные исследования в этом направлении связаны с изучением взаимодействия стромальных клеток с белками внеклеточного матрикса и исследованием биологических механизмов влияния клеток на патологические процессы. Были отработаны методики получения МСК из костного мозга крысы, кролика и человека; доказана их способность к дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. В работе использовали недифференцированные и индуцированные в остеогенном и хондрогенном направлениях МСК на скаффолдах различного состава.
Основные задачи проводимых исследований:
Тестирование материалов в условиях in vitro. Изучение биосовместимости материала и клеток (токсикологические исследования в тест-системах in vitro) и оценка индуктивных свойств материала по способности клеток к направленной дифференцировке.
Создание БМКП для устранения дефектов костной и хрящевой тканей. Подбор материала для определенного дефекта (заболевания), способа совмещения материала и клеток. Исследование биологических механизмов и эффективности участия введенных клеток на патологические процессы.
Основные результаты выполненных исследований:
Определена характеристика остеоиндуктивных свойств композитных скаффолдов из поли(L‑лактида), модифицированных коллагеном I типа, фибрином, глицерофосфатом кальция, предназначенных для восстановительной хирургии костной ткани.
Определена характеристика модифицированных хондроитинсульфатом скаффолдов на основе поли(L‑лактида) различной пористости с целью использования в восстановлении хрящевой ткани.
Выполнено сравнительное исследование морфофункциональных свойств (адгезия, пролиферация, миграция, дифференцировка) МСК костного мозга, хондроцитов, остеоцитов и фибробластов пациентов с остеоартрозом под влиянием электростатического поля электретного стимулятора остеорепарации.
На рисунке: МСК костного мозга кролика при росте на разных поверхностях: а – биоситалл, в – полилактид 3D-скаффолд, б – после остеогенной дифференцировки, и окраски ализариновым красным и г – DAPI, АТ к Runх.
Выполнены исследования по выбору оптимального остеозамещающего материала для пластики операционных дефектов в хирургии туберкулеза костей и суставов. Исследованы in vivo остеоиндуктивные свойства композитов на основе биоситалла на здоровых кроликах и кроликах, зараженных туберкулезом.
Выполнено исследование свойств состава (концентрата) кондиционированной среды от культивируемых МСК человека (линии FetMSC) после их дифференцировки в остеогенном направлении, перспективного для разработки БМКП на основе секретома МСК, предназначенного для восстановления костной ткани.
Биомедицинские клеточные технологии и продукты для репаративной регенерации кожи (Александрова О.И., Блинова М.И. – равное участие; Дарвиш Д.М., Нащекина Ю.А, Горячая Т.С., Ярцева Т.В., Хотин М.Г.; студенты – Едоменко Н.В., Гречаная Ю.С., Журенков К.Э.)
Кожа – самый тонкий, прочный и большой орган человеческого организма, является его защитой. При повреждении кожи требуется незамедлительное восстановление ее нормальной структуры и функций. При обширных ожоговых ранах токсичность продуктов распада тканей, инфицирование ран, водно-электролитные, белковые и энергетические потери определяют ведущую роль таких ран в патогенезе ожоговой болезни и ее осложнений. Одной из главных задач лечения пострадавших от ожогов является совершенствование методов адекватного пластического закрытия раны. Традиционным методом пластического восстановления целостности кожных покровов при обширных глубоких ожогах является аутопластика сетчатых перфорированных кожных лоскутов Основная проблема этого метода – нехватка или недоступность донорского материала. Одним из подходов современной регенеративной медицины, является разработка эквивалентов кожи (ЭК) с использованием клеточных технологий. К настоящему времени за рубежом создано множество ЭК (дермальные, эпидермальные и смешанного типа) с использованием клеток кожи (кератиноциты, фибробласты) и мезенхимальных стромальных клеток разного происхождения, культивируемых на различных носителях. В России пока наиболее зарекомендованным и востребованным клеточным продуктом для этих целей является эквивалент дермальный (ЭД) на основе дермальных фибробластов и коллагенового гидрогеля, разработанный ранее в ИнЦ РАН. В настоящее время совместно с Институтом скорой помощи им. И.И. Джанелидзе, кроме обеспечения текущих клинических потребностей дермальным эквивалентом, мы проводим экспериментальные исследования по разработке ЭК с фибробластами и кератиноцитами, способными полноценно заменить аутопластику перфорированным кожным лоскутом при лечении ожогов. Такой клеточный продукт востребован и для заживления трофических язв и коррекции других дефектов кожи.
На рисунке: клетки кожи человека в культуре и ЭК (слева направо): кератиноциты; фибробласты; эквивалент кожи на основе коллагенового геля.
В настоящее время:
1. Отработаны методы выделения и культивирования стволовых клеток (СК) эпидермиса и дермы человека.
2. Проводится работа по созданию биобанка СК дермы – дермальных фибробластов (ДФ).
3. Отрабатывается технология обеспечения клинических потребностей эквивалентом дермальным (ЭД) для лечения ожогов и трофических язв.
4. Разрабатывается технологии приготовления эквивалентов кожи (ЭК) для замещения обширных дефектов кожных покровов, на основе используемого эквивалента дермального совместно с кератиноцитами.
In vitro тест-системы для оценки влияния фармакотерапии на клеточную составляющую биоинженерных конструкций роговицы (Александрова О.И., Блинова М.И. – равное участие; Хорольская Ю.И.; студенты – Журенков К.Э., Переплетчикова Д.А., Гречаная Ю.С.).
Не менее важной задачей клинической офтальмологии является сохранение структуры и физиологической функции роговицы при лекарственной терапии. Локальное применение препаратов в конъюнктивальную полость непосредственно воздействует на эпителий роговицы и конъюнктивы, оказывая влияние на скорость репарации тканей глаза. Исследования влияния офтальмологических препаратов на жизнеспособность клеток тканей глаза в условиях in vitro, могут способствовать правильному подбору глазных капель, при использовании которых в комплексной терапии глазной патологии, минимизируется риск реализации цитотоксических эффектов. Разработка модельных тест-систем на основе культивируемых клеток различных тканей глаза для изучения действия офтальмологических препаратов на жизнеспособность клеток в условиях in vitro может решить проблему устранения нежелательных реакций, возникающих при лекарственной терапии, что будет способствовать сохранению и поддержанию регенераторного потенциала клеток роговицы. В настоящее время, совместно с Санкт-Петербургским филиалом МНТК “Микрохирургия глаза” им. акад. С. Н. Федорова мы проводим исследования по разработке тест-систем in vitro для оценки возможного влияния фармакотерапии на клеточный компонент БИК роговицы.
1. Подобраны условия и методы оценки цитотоксичности, при которых возможно выявить и сравнить действие глазных капель на культивируемые клетки.
2. В условиях in vitro с помощью выбранных методов проведено сравнительное исследование цитотоксичности офтальмологических препаратов различных групп: антибиотиков, нестероидных противовоспалительных препаратов, глюкокортикостероидов, антисептиков, анестетиков, медриатиков и препаратов слезозаместительной терапии.
3. На основании проведенных исследований было выявлено, что внутри фармакологических групп препараты различаются по степени и характеру токсичности, которые зависят не только от действующего вещества, но и от вспомогательных компонентов и консервантов. Проводятся исследования по разработке тест-систем на основе тканей глаза.
На рисунке: Гистограмма – жизнеспособность (%) клеток эпителия роговицы человека (HCEC) на 3‑й день культивирования в среде с исследуемыми препаратами слезозаместительной терапии, в концентрации 10% от объема питательной среды (MTT-тест). Блок фотографий – морфология HCEC в среде с разными препаратами (ФКМ).