Научные проекты
Генотерапевтические векторы на основе искусственных хромосом человека (Синенко С.А. и Пономарцев С.В. – равное участие, Скворцова Е.В., Воропаев И.Н., Савина М.М.)
Проект направлен на разработку тканезаместительной генотерапии на основе альфоидных искусственных хромосом человека (альфоидные-ИХЧ) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для лечения моногенных генетических заболеваний в мышиной модельной системе. Альфоидные-ИХЧ являются de novo синтезированными кольцевыми хромо- сомными единицами, содержащими повторяющиеся последовательности альфоидной центромерной ДНК с сайтами встраивания для различных генетических конструкций (трансгенов). Данные альфоидные-ИХЧ способны дуплици роваться и поддерживаться как 47 хромосома в ядре клеток человека. Мы используем данные альфоидные-ИХЧ в качестве вектора для доставки терапевтических генов в плюрипо- тентные стволовые клетки, полученные из соматических клеток мышей, в которых функция соответствующих генов нарушена.
Одним из важных вопросов технологии искусственных хромосом человека является усовершенствование ММСТ метода переноса альфоидных-ИХЧ. Мы используем различные варианты ММСТ метода и проводим исследования, направленные на повышение эффективности данного метода для переноса альфоидных-ИХЧ в различные плюрипотентные стволовые клетки.
Исследование молекулярных механизмов клеточного репрограммирования в плюрипотентное состояние (Синенко С.А., Скворцова Е.В., Кузьмин А.А.)
Совершенствование технологии получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) является важной задачей современной биомедицинской науки и регенеративной медицины. иПСК имеют некоторые значительные отличия от эмбриональных стволовых клеток, что не позволяет их полноценное использование в тканезаместительной терапии на основе стволовых клеток. Наши исследования направлены на установление роли ряда факторов в процессе клеточного репрограммирования и поддержания плюрипотентности. В частности, мы исследуем влияние функции ряда транскрипционных и хроматин-ассоциированных факторов, биогенного амина (серотонина), митохондрии на процесс репрограммирования в плюрипотентное состояние.
Создание универсальных иммунотолерантных иПСК и дендритно-клеточных антивакцин для тканезаместительной терапии (Синенко С.А., Пономарцев С.В., Скворцова Е.В., Воропаев И.Н.)
В современной трансплантологии до сих пор остаётся нерешённой проблема хронического отторжения, которое может развиваться через продолжительное время после пересадки донорских тканей или органов.
Причиной хронического отторжения является гентическое разнообразие поверхностных антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и аллельным полиморфизмом других белков иммунной системы. Огромное разнообразие ГКГС гаплотипов значительно снижает вероятности подбора пары «донор-реципиент», которые полностью совпадает по антигенам тканевой совместимости.
В связи с этим, как для трансплантации тканей, так и для тканезаместительной терапии важным является разработка подходов для специфической толерогенной модуляции иммунной системы реципиента, а также разработка универсальных гипоиммуногенных тканей на основе плюрипотентных стволовых клеток.
В настоящее время сделан значительный прорыв в понимании молекулярных механизмов регуляции иммунологической толерантности. Мы занимаемся разработкой методов получения толерогенных дендритных клеток из иПСК с целью их использования в качестве специфических иммуносупрессорных клеток, “обучающих” иммунную систему реципиента аллоантигенам донора. Также мы ведем исследование по созданию универсальных гипоиммуногенных иПСК и их производных клеток и тканей с помощью изменения или редактирования молекул ГКГС.
Роль полиЦ-связывающих белков в плюрипотентных стволовых клетках (Бахмет Е.И., Назаров И.Б., Гордеев М.Н., Потапенко Е.)
ПолиЦ-связывающие белки экспресируются во всех типах клеток, и участвуют в таких процессах, как регуляция транскрипции, сплайсингa, поддержание стабильности мРНК, и регуляция трансляции белков. Нами ведутся работы по выявлению специфических функций этих белков в плюрипотентных стволовых клетках (ПСК), прежде всего, на уровне транскрипции.
Для достижения поставленных задач мы используем различные методы от классических биохимических (гель-ретардация, аффинная хроматография) до NGS-секвенирования. На данный момент мы показали, что белок hnRNP‑K связывается с дистальным и проксимальным энхансерами ключевого для ПСК гена Pou5f1, а также является маркером открытого хроматина. В данный момент, мы исследуем функции белка Pcbp1 в ПСК.ПолиЦ-связывающие белки экспрессируются во всех типах клеток, и участвуют в таких процессах, как регуляция транскрипции, сплайсингa, поддержание стабильности мРНК, и регуляция трансляции белков. Нами ведутся работы по выявлению специфических функций этих белков в плюрипотентных стволовых клетках (ПСК), прежде всего, на уровне транскрипции. Для достижения поставленных задач мы используем различные методы от классических биохимических (гель-ретардация, аффинная хроматография) до NGS-секвенирования.
На данный момент мы показали, что белок hnRNP‑K связывается с дистальным и проксимальным энхансерами ключевого для ПСК гена Pou5f1, а также является маркером открытого хроматина. В данный момент, мы исследуем функции белка Pcbp1 в ПСК.ПолиЦ-связывающие белки экспрессируются во всех типах клеток, и участвуют в таких процессах, как регуляция транскрипции, сплайсингa, поддержание стабильности мРНК, и регуляция трансляции белков. Нами ведутся работы по выявлению специфических функций этих белков в плюрипотентных стволовых клетках (ПСК), прежде всего, на уровне транскрипции. Для достижения поставленных задач мы используем различные методы от классических биохимических (гель-ретардация, аффинная хроматография) до NGS-секвенирования. На данный момент мы показали, что белок hnRNP‑K связывается с дистальным и проксимальным энхансерами ключевого для ПСК гена Pou5f1, а также является маркером открытого хроматина. В данный момент, мы исследуем функции белка Pcbp1 в ПСК.
Роль факторов плюрипотентности в ранней дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток (Бахмет Е.И., Гордеев М.Н.)
Известно, что белки Oct4, Sox2 и Nanog являются маркерами плюрипотентных стволовых клеток (ПСК). Благодаря этим транскрипционным факторам реализуется программа экспрессии генов, способствующих поддержанию плюрипотентности, и как следствие, способности ПСК дифферен цироваться в производные энто‑, мезо- и эктодермы.
Также в литературе существуют свидетельства роли каждого из этих факторов в ранней дифференцировке ПСК. Так, было показано, что Oct4 оказывается необходим для формирования мезодермы, Nanog – для дифференцировки энто дермы, а Sox2 – для развития нейроэктодермы. Таким образом, их можно рассматривать не как плюрипотентные, но как ранние маркеры дифференцировки, которые уравновешивают друг друга в стандартных условиях культивирования ПСК. Цель нашей работы состоит в выявлении молекулярно-биологических механизмов, благодаря которым Oct4, Sox2 и Nanog запускают программу той или иной дифференцировки. Для достижения этой цели нами используются такие методы, как ChIP-seq, редактирование генома с помощью системы CRISPR/Cas9, репортерные конструкции, проточная цитометрия и цейтраферная съёмка. В настоящий момент идёт создание репортерных линий ПСК, отражающих экспрессию основных маркеров ранней дифференцировки (Foxa2, Brachyury, Sox1) в режиме реального времени.
Исследование роли негистоновых белков семейства HMGB в хроматине ЭСК (Старкова Т.Ю., Чихиржина Е.В., Поляничко А.М., Беляев А.В.)
Негистоновые белки HmgB1 и HmgB2 представляют собой широко распространенные структурно-регуляторные белки хроматина, которые в зависимости от своего окислительно-восстановительного состояния и модификационного статуса обладают целым спектром функций, начиная от их участия в таких клеточных процессах, как транскрипция, репликация и репарация ДНК и заканчивая активированием путей противовоспалительного и иммунного ответа. Главная цель нашего исследования – выявление роли данных белков в структурно-регуляторной организации хроматина эмбриональных стволовых клеток мыши, в поддержании клеточной плюрипотентности и дифференцировке. Для достижения поставленной цели нами применяется подход, основанный на сочетании таких методов исследования как масс-пектрометрия, сайт-направленный мутагенез, иммуноцитохимический анализ, CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут и сверхэкспрессия генов, дифференцировка ЭСК, исследование 3D организации генома методом Hi‑C и др. Одними из самых важных и интересных результатов наших исследований является выявление ряда ЭСК-специфических модификаций HmgB1, установление корреляции между уровнем экспрессии HmgB2 и маркером плюрипотентного состояния Oct4 как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Мы показали также, что уровень экспрессии HmgB2 существенно влияет на переход от наивной плюрипотентности, свойственной клеткам до имплантации, к праймированной, соответствующей раннему пост-имплантационному периоду.
Поиск возможных функций транскрипционного фактора Oct4 в дифференцированных клетках (Кузьмин А.А., Ермакова В.В., Островерхова М.Г.)
Данное направление основывается на изучении феномена клеточной пластичности и вовлечённости в него транскрипционного фактора Oct4. В настоящий момент показано его участие в увеличении клеточной пластичности в экспериментах in vitro на моделях репрограммирования, а также in vivo в модели атеросклероза. Для того, чтобы оценить потенциальный вклад гена Oct4 в процессы клеточной пластичности, в нашей лаборатории была разработана система, позволяющая отслеживать в автоматическом режиме запуск его экспрессии. В настоящий момент работа основывается на использовании данной системы в контексте дифференцированных из эмбриональных стволовых линий клеток, а также раковых стволовых клеток. В то же время ведутся работы по созданию трансгенных мышей, несущих в себе данные конструкции для in vivo экспериментов. В перспективе, будут проведены исследования по поиску процессов, в которые может быть вовлечен Oct4, помимо поддержания статуса плюрипотентности.
Исследование пространственной роли гена Oct4 в организации работы MHC-локуса мыши (Ермакова В.В., Кузьмин А.А.)
Помимо связывания специфичных мотивов на ДНК в роли транскрипционного фактора, Oct4 также может иметь дополнительные регуляторные функции, обусловленные последовательностью своего гена. Известно, что промоторы, помимо их классических функций в инициации транскрипции могут выполнять роль энхансеров. В свою очередь, мы хотим выяснить, обладает ли промоторная область гена Oct4 регуляторными функциями для соседних групп генов гистосовместимости, и какова функциональная значимость такой регуляции в контексте развития эмбриона. Для того, чтобы оценить топологические функции гена Oct4 нами была проведена работа по биаллельному делетированию его промоторных областей с одновременным переносом его последовательности в другой локус – Rosa26. Таким образом, эти клетки остаются эмбриональными стволовыми за счёт экспрессии Oct4. Данные манипуляции позволят нам исследовать пространственную роль гена Окт4 в отношении близлежащих генов, как в эмбриональных, так и в дифференцированных клетках.
Структурна организация комплексов ДНК с ядерными белками (Чихиржина Е.В., Поляничко А.М., Старкова Т.Ю.)
Структурная организация ДНК в хроматине интенсивно изучалась в течение многих лет. Когда структура нуклеосомы была решена, исследования более высоких уровней структурной организации стали одним из наиболее важных шагов в понимании функционирования хроматина в целом. Большое разнообразие ДНК-связывающих белков взаимодействует с ДНК, образуя сложные ДНК-белковые комплексы. Исследование взаимодействия ДНК с ключевыми в функционировании хроматина «линкерными» белками (гистон Н1 и HMGB-доменные белки) находится в поле нашего зрения уже многие годы. Нами используются разнообразные спектроскопические и физико-химические подходы к исследованию ДНК-белковых комплексов, в т.ч. методы кругового дихроизма и абсорбционной спектроскопии в УФ и ИК диапазонах и атомной силовой микроскопии (АСМ). Использование данных методик позволяет не только исследовать природные структурно-функциональные комплексы белков и НК, но также работать над созданием искусственных структурно упорядоченных систем на основе ДНК и линкерных белков хроматина.