Дополнительная информация

Группа молекулярной цитологии прокариот и бактериальной инвазии сформирована в сентябре 2019 года. Под её крылом объединены тематики, тем или иным образом связанные с изучением прокариотической клетки. Исследования, проводимые Группой, берут своё начало в Лаборатории структурной организации генома (руководитель – д.б.н., проф. С.Н. Борхсениус) и Лаборатории биологии клетки в культуре (руководитель – д.б.н. Г.Г. Полянская; руководитель научного направления – д.б.н. С.Ю. Хайтлина).

Работа группы направлена на изучение структурных особенностей клеток прокариот и выявление механизмов взаимодействия микоплазм и условно-патогенных бактерий с клетками эукариот. В соответствии с этой задачей исследования проводятся в двух направлениях:
(1) Молекулярная цитология прокариот; (2) Бактериальная инвазия.

(1) Исследования, проводимые в рамках первого направления (руководитель – к.б.н., с.н.с. И.Е. Вишняков):

• Генетические, молекулярно-биологические и цитологические исследования, связанные с изучением цитоскелета и подвижности клеток микоплазм;
• Исследование процессов репликации нуклеоида и деления клеток микоплазм и других прокариот;
• Разработка и адаптация методов электронной микроскопии и локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения для изучения тонкой структуры микоплазм и других прокариот;
• Изучение генов и белков микоплазм, связанных с ответом бактериальной клетки на стресс;
• Изучение генетического материала микоплазм, обнаруженного в составе метагеномов образцов многолетнемѐрзлых пород Арктики;
• Исследование генетических и молекулярно-биологических основ причинно-следственных связей микоплазменной инфекции с онкологическими заболеваниями;
• Разработка генетических и молекулярно-биологических методов обнаружения микоплазм в биологическом материале (диагностика микоплазмозов).

Участники: д.б.н., проф. С.Н. Борхсениус; д.б.н., с.н.с. А.Р. Каюмов; к.б.н. А.Д. Ведяйкин; аспирант Л.С. Чернова (рук. А.Р. Каюмов); студенты А.В. Шабалина, Я.В. Егорова, Е.В. Пономарёва, Н.А. Румянцева.

Основные результаты:
Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки FtsZ микоплазм трех видов (Mycoplasma hominis, M. gallisepticum и Acholeplasma laidlawii). Установлено, что все три рекомбинантных белка FtsZ способны взаимодействовать с комплексом белков деления Escherichia coli (включая ингибирование цитокинеза). В рамках сотрудничества с НИК «Нанобиотехнологии» Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого впервые применены самые современные методы локализационной микроскопии (SMLM, или dSTORM, в том числе 3D, а также SRRF) для визуализации структур, формируемых различными белками в клетках микоплазм. Применение таких методов вкупе с методами электронной и иммуно-электронной микроскопии открывает новые возможности для изучения комплексных структур в бактериальных клетках, особенно столь малого размера, как клетки микоплазм. Идентифицированы белки-мишени, ко-элюируемые с белком IbpA (малый белок теплового шока, играет одну из ключевых ролей в выживании клетки в условиях кратковременных стрессов) из клеточного экстракта микоплазмы A. laidlawii, в том числе после экспонирования при низких и высоких температурах. Большинство потенциальных мишеней мБТШ определены, как ферменты, вовлечѐнные в биосинтетические циклы и энергетический метаболизм. Продемонстрирована специфичность взаимодействия IbpA с белками-мишенями в зависимости от температуры инкубации. В рамках сотрудничества с КИББ КазНЦ РАН показано присутствие мБТШ IbpA в мини-телах и внеклеточных везикулах микоплазмы A. laidlawii. Идентифицированы белки-партнѐры гомологов ключевого белка бактериального деления FtsZ в клетках микоплазм M. gallisepticum и A. laidlawii методами коиммунопреципитации и со-осаждения. Выявлено, что спектры белков-партнѐров микоплазменных FtsZ в клетках E. coli и самих микоплазм отличаются. Показано, что FtsZ в клетках микоплазм не формирует «классическое» Z‑кольцо. В рамках сотрудничества с ИФХиБПП РАН обнаружен и охарактеризован генетический материал современных и древних микоплазм в метагеномах образцов многолетнемѐрзлых пород Арктики. В рамках сотрудничества с ФНКЦ ФХМ ФМБА России методами иммуноэлектронной микроскопии показана ассоциация токсина Bacteroides fragilis с внеклеточными везикулами бактерии и продемонстрирован новый механизм его секреции. Исследовано восстановление процесса деления клеток E. coli после его нарушения под действием экспрессии белка SOS-ответа SulA. Показано, что клетки способны быстро восстанавливать нормальное деление, при этом главным механизмом правильного позиционирования септы, по-видимому, является механизм нуклеоидной окклюзии. Кроме того, белок FtsZ формирует кольца деления в удлиненной клетке не сразу, а через этап образования спиралеобразных форм. Показана эффективность использования диагностических систем для рутинной проверки чистоты клеточных культур как для качественного выявления возможной контаминации, так и для количественных оценок с расчѐтом вирусной нагрузки, подобно тому, как это практикуется в клинической диагностике.

(2) Исследования, проводимые в рамках второго направления (руководитель – д.б.н., в.н.с. С.Ю. Хайтлина):

• Выявление структурно-функциональных связей в актине и его комплексах с актин-связывающими белками в связи с их участием в процессах биологической подвижности;
• Исследование механизмов инвазии эукариотических клеток бактериями рода Serratia, продуцентами открытой нами актин-специфической протеазы.

Участники: к.б.н., c.н.с. Е.С. Божокина; к.б.н., с.н.с. О.Ю. Цаплина; аспирант А.П. Ивлев (рук. С.Ю. Хайтлина).

Основные результаты:
Открыт, выделен и охарактеризован новый фермент – металлопротеаза бактерий Serratia grimesii ЕСР 32/гримелизин, специфически расщепляющая актин. ЕСР 32/ гримелизин расщепляет только одну полипептидную связь, которая не расщепляется другими известными протеазами, что приводит к обратимой потере способности актина к полимеризации. Показано также, что аналогичными свойствами обладает аналог гримелизина, протеаза протеализин (Demidyuk et al., 2006; Tsaplina et al., 2009, 2012), выделенная из бактерий Serratia proteamaculans. Эти свойства сделали протеазу ЕСР/гримелизин уникальным инструментом для изучения функциональных особенностей актина, активно используемым как в работе группы, так и в других лабораториях. В частности, недавно было впервые показано, что тропомиозин подавляет усиленный обмен субъединиц в Ф‑актине, специфически расщепленном протеазой гримелизин, и этот стабилизирующий эффект тропомиозина кооперативен. Впервые показано, что фторид натрия активирует начальную стадию полимеризации актина в растворе и сборку актиновых структур в культивируемых клетках.
Высокая специфичность протеазы ЕСР 32/гримелизин и поиски собственных бактериальных субстратов протеазы привели нас к открытию инвазивной способности бактерий – продуцентов протеазы. Мы показали, что рекомбинантные Escherichia coli, экспрессирующие ген гримелизина или протеализина, становятся инвазивными. Мы предполагаем, что протеаза ЕСР 32/гримелизин может быть вирулентным фактором, и актин является мишенью протеазы при ее попадании в клетку.
В настоящее время работа направлена на выявление механизмов инвазии бактерий, продуцентов актин-специфической протеазы. С помощью электронной микроскопии выявлены начальные стадии проникновения бактерий S. grimesii в клетки M‑HeLa. Показано, что этот механизм, вероятно, соответствует “триггерному” механизму инвазии. Выявлена колокализация бактерий S. grimesii с Е‑кадгерином клеток разного происхождения, что указывает на возможное участие Е‑кадгерина в процессе проникновения бактерий S. grimesii в клетки эукариот. Впервые показано участие сигнальных путей c‑Src и RhoA/ROCK в инвазии эукариотических клеток условно-патогенными бактериями S. grimesii. Показано участие поверхностного белка бактерий OmpX в инвазии бактерий S. proteamaculans. Впервые выделены мембранные везикулы бактерий S. grimesii и показано, что они содержат гримелизин, проникают в клетки эукариот, и увеличивают инвазию бактерий в клетки эукариот. Все эти исследования продолжаются.